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ELISA方法的建立中包被濃度的問題

日期:2025-04-29 08:15
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摘要: ELISA方法的建立中包被濃度的問題 包被濃度一般通過方陣ELISA來確定。 經(jīng)典的方陣ELISA是將抗原和抗體各自稀釋成不同梯度濃度,結(jié)果將OD值P/N>2的均判為陽性,選取OD值在1.0左右的那個Ag-Ab濃度為*佳工作濃度, 但是,對于抗原抗體而言,由于它們被稀釋成不同濃度,那么在理論上,每個抗原稀釋度下,總有一個抗體的稀釋度其OD值在1.0左右,那么到底選取哪一個OD值1.0左右的好呢?這就需要同時用**做個抑制來看,也就是說,每個抗原抗體稀釋度下,需要同時做間接及間接競爭ELISA.哪個濃度下抑制情況...

ELISA方法的建立中包被濃度的問題

包被濃度一般通過方陣ELISA來確定。

經(jīng)典的方陣ELISA是將抗原和抗體各自稀釋成不同梯度濃度,結(jié)果將OD值P/N>2的均判為陽性,選取OD值在1.0左右的那個Ag-Ab濃度為*佳工作濃度,

但是,對于抗原抗體而言,由于它們被稀釋成不同濃度,那么在理論上,每個抗原稀釋度下,總有一個抗體的稀釋度其OD值在1.0左右,那么到底選取哪一個OD值1.0左右的好呢?這就需要同時用**做個抑制來看,也就是說,每個抗原抗體稀釋度下,需要同時做間接及間接競爭ELISA.哪個濃度下抑制情況好,就取哪個抗原抗體濃度做工作濃度.

ELISA問題我總結(jié)了一下,你們可以去看看.


我碰到過所有孔都一樣藍的情況,從兩方面找原因了:

一是調(diào)整酶的濃度。ELISA反應(yīng)中酶是關(guān)鍵因素之一,酶濃度高會導(dǎo)致P/N比拉不開。處理:在別的條件不變的情況下,對酶做梯度稀釋,10倍一個梯度。酶稀釋到了合適的濃度,結(jié)果一下就好看了。

二是排除封閉不好的問題。我用過自己配的BSA封閉和國外試劑盒配的封閉液,雖不是天上人間的差別,至少也是清晰與模糊的距離。這個雖然不是關(guān)鍵問題,在試驗不好又找不到突破的時候,也別放過可能的失誤吧。

你可以通過方陣實驗,確定抗原抗體的*佳結(jié)合濃度。

具體的方法:將抗原稀釋成不同梯度的濃度包被,抗體也稀釋成不同的濃度梯度,加二抗,顯色。一般選OD值在1.0左右的抗原抗體結(jié)合濃度。

你還有什么具體的要求,說清楚一點,再幫你解答。

逐點分析啊:

就你包被的單抗來說,對于標準品來說已經(jīng)是遠遠過量了,所以這個梯度對于你的實驗來說,沒有起到相應(yīng)的作用。

標準品的總梯度也不夠大,不過8倍而已,建議增加梯度。同理一抗的梯度,因為如果你的蛋白比較大,即使是1:2000稀釋也足以結(jié)合掉所有的標準品了,板子一片藍也就不可避免了。

另外關(guān)于封閉液,不知你用的是什么,如果是BSA應(yīng)該不會有問題。

把生物素二抗加HRP 的系統(tǒng)直接換成了HRP結(jié)合的二抗,結(jié)果不是一片藍了,可看出濃度梯度。但是空白還是比較高,OD值在0.3--0.6左右。結(jié)果樣本測定均小于空白值。

重新用10%FBS封閉過夜,結(jié)果BSA PBS孔(空白對照)為0.373, PBS孔0.45, FBS PBS 孔0.309。樣本還是大部分低于空白。但是如果樣本以FBS 孔為空白(樣本為細胞培養(yǎng)上清,都含有10%FBS),則部分樣本有結(jié)果。

滬公網(wǎng)安備 31011702004399號

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